CLASSIC LIVER LOBULE AS A MODEL FOR STUDYING THE INFLUENCE OF CADMIUM SUBTOXIC DOSES

Full Text

Тяжелый металл кадмий (Cd) вносит огромный мимикрии - замещении в клетках ионов кальция, что вклад в загрязнение окружающей среды наряду с приводит к трансформационной белковой недостаточпестицидами, нефтепродуктами и нитратами. Около ности, стрессу цитоплазматической сети и последую- 30 тонн Cd ежегодно попадает в среду жизнедея- щей гибели клеток. Кроме того, продемонстрированы тельности человека и распространяется по пищевым канцерогенные и иммунотоксичные эффекты ионов цепочкам [10]. Токсичность Cd основана на ионной Cd на уровне клетки и организма [5]. 47 Экологическая морфология Экология человека 2018.01 Для снижения кадмиевой интоксикации предложены антиоксиданты и хелаты, хотя их дозировка и побочные эффекты находятся в стадии изучения, поэтому стратегии протекции и детоксикации, которые обеспечивают защиту клеток без риска канцерогенеза, являются предметом поиска [16]. Дозозависимая гепатотоксичность Cd достаточно хорошо изучена в эксперименте; продемонстрированы гепатомегалия, липидная инфильтрация гепатоцитов, гиперплазия эпителия холангиол, а также дистрофия, дегенерация и некроз паренхиматозных клеток печени [4, 17]. Тем не менее патологические эффекты этого тяжелого металла не исследованы у неполовозрелых экспериментальных животных в аспекте внутриклеточного регенераторного потенциала гепатоцитов с учетом их локализации в классической печеночной дольке - тканевой модели печени, учитывающей артериовенозный градиент, совпадающий с вектором клеточного обновления [11]. Цель исследования - анализ структурных особенностей печени крыс-самцов-adolescents Вистар при подостром (в субтоксичных дозах) воздействии Cd. Методы Крысы самцы-adolescents Вистар (10 особей) в возрасте 4 недель, содержащиеся в стандартных условиях вивария, per os получали растворы, включающие соль Cd (3CdSO4*8H2O) в суточной дозе 0,5 мг/кг в течение 21 суток. Контрольная группа (10 крыс-самцов Вистар аналогичного возраста и массы тела) получала такой же корм без добавления соли тяжелых металлов. Животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Образцы печени фиксировали в охлажденном до 4 °С 4 % растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,3) в течение суток. Для электронно-микроскопической проводки ткань дофиксировали в 1 % растворе OsO4, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне и заливали в смесь эпона-812, DDSA и аралдита-M; блоки полимеризовали в термостате 60 °С в течение одних суток. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие (300-500 нм) срезы получали на ультрамикротоме LKB III (Швеция). Полутонкие срезы монтировали на обезжиренные предметные стекла и окрашивали на гистологическом столике (37 °С) в капле 1 % раствора толуидинового синего, приготовленного на 1 % водном растворе буры. Полутонкие срезы изучали с помощью микроскопа Axio Scope.A1 (С. Zeiss) с учетом представления о классической дольке печени, выделяя перипортальную, центроло-булярную и перивенулярную зоны [12]. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца в парах щелочи натрия по Рейнольдсу и исследовали в электронных микроскопах JEM 100-S и JEM 1400 (Япония) при ускоряющих напряжениях 60 и 80 кВт соответственно. Для стереологического изучения образцов печени использовали методы, основанные на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры. Тканевый стереологический анализ (изучение структурной плотности гепатоцитов и синусоидов в порто-центральном градиенте печеночной дольки) проводили на полутонких срезах, оценивая по 5-7 неперекрываемых полей зрения в каждом случае, по 50 на группу, при увеличении 650 с помощью тестовой системы коротких отрезков (n = 36, P = 72, L = 190 мкм). Ультраструктурный стереологический анализ (по 50 электронограмм перипортальных, центролобулярных и перивенуляр-ных гепатоцитов соответственно на каждую группу из 5 мышей, начальное увеличение от 4 до 8 тысяч) осуществляли при конечном увеличении в 22 х 103 раз с помощью программы Image J 1.7. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием статистического пакета SPSS17.0. Для оценки значимости различий между группами использовали непараметрический метод Манна - Уитни. Данные представлены как среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (m). При оценке статистических гипотез принимался уровень значимости p < 0,05. Результаты В обеих группах при светооптическом исследовании полутонких срезов образцов печени крыс-adolescent Вистар тканевая архитектоника была сохранена с умеренно выраженным полиморфизмом гепатоцитов, отражающим структурно-функциональный порто-цен-тральный градиент в зависимости от локализации в классической печеночной дольке и, соответственно, условий артериального кровоснабжения. По сравнению с контрольной группой в опытной при воздействии соли тяжелого металла в пери-портальной зоне отмечались моноцеллюлярные и мелкие фокусы некробиоза и некроза с деструкцией гепатоцитов и реактивной слабо выраженной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами. По-видимому, в связи с продукцией этими клетками вазоактивных цитокинов просветы синусоидов были неравномерно расширены, и их объемная плотность значимо (p = 0,043) превышала показатель контрольной группы (табл. 1). Тем не менее большинство перипортальных паренхиматозных клеток печени при электронномикроскопическом исследовании не демонстрировали признаков альтерации. Клетки преимущественно одноядерные, с центральным расположением ядер, однако, в отличие от таковых в контрольной группе, с более редкими ядрышками и выраженной долей маргинального гетерохроматина, что позволяло визуализировать расширенные ядерные поры. В цитоплазме перипортальных гепатоцитов лока 48 Экология человека 2018.01 Экологическая морфология лизованы все мембранные органеллы, свойственные нормальной ультраструктурной организации поли-функциональной клетки печени: канальцы гранулярной цитоплазматической сети, аппарат Гольджи, многочисленные мелкие митохондрии с плотным матриксом, лизосомы и мультивезикулярные тельца. Однако в опытной группе по сравнению с контрольной объемная плотность профилей гранулярной цитоплазматической сети была значимо (p = 0,008) снижена, что сопровождалось их дегрануляцией, очаговой вакуолизацией, а также наличием в цитоплазме мелких диффузных липидных капель, иногда контактирующих с митохондриями. Эти отличия свидетельствовали о проявлениях ишемии в большинстве перипортальных гепатоцитов. Центролобулярный компартмент у подопытных крысят на тканевом уровне не имел выраженных отличий от такового в печени контрольной группы, а также от перипортальной зоны печеночных долек. Центролобулярные клетки печени характеризовались полиморфизмом: в состоянии умеренной дистрофии, с тотальной опустошенностью цитоплазмы, либо «темные» гепатоциты, более компактные, с депонированием гликогена. Отмечалась лишь тенденция расширения просветов синусоидов, нередко со стазом эритроцитов (табл. 1). Значения объемной плотности цитоплазмы гепатоцитов в условиях токсического воздействия значимо (p = 0,0001) превышали показатель перипортальной зоны, что отражало достаточно часто встречаемый феномен баллонной дистрофии центролобулярных гепатоцитов. При электронно-микроскопическом исследовании обращали на себя внимание редукция профилей цитоплазматической сети с сохранением ее пери-нуклеарного компартмента и ультраструктурные эквиваленты «стресса» - складки осмиофильных мембран в вакуолях. Наряду с этим в цитоплазме центролобулярных гепатоцитов обнаружена слабо или умеренно выраженная мелковезикулярная липидная инфильтрация. Объемная плотность митохондрий была значимо снижена по сравнению с показателем контрольной группы (p = 0,002) и по сравнению Тканевый стереологический анализ печени (Vv, мм3/см3) крыс Вистар при Cd-токсическом воздействии, М ± m Таблица 1 Группа Перипортальная зона Центролобулярная зона Перивенулярная зона Гепатоциты Синусоиды Гепатоциты Синусоиды Гепатоциты Синусоиды Контроль 685,31 ± 10,50 102,01 ± 4,79 699,91 ± 6,09 118,68 ± 6,36 729,90 ± 14,38 121,40 ± 5,22 Опыт 705,84 ± 7,93 *p = 0,140 119,78 ± 5,44 *p = 0,043 719,14 ± 8,66 *p = 0,121 #p = 0,212 125,33 ± 7,08 *p = 0,473 #p = 0,597 749,51 ± 14,38 *p = 0,326 #p = 0,023 &p = 0,131 146,20 ± 6,02 *p = 0,007 #p = 0,008 &p = 0,059 Примечание для табл. 1-2. * - сравнение с контрольной группой, # - сравнение с аналогичными показателями перипортальной зоны, & - сравнение с аналогичными показателями центролобулярной зоны. Сравнительная ультраструктурная характеристика гепатоцитов крыс-самцов-adoleseent Вистар в зависимости от локализации в классической дольке печени. Ув. 4 000. 49 Экологическая морфология Экология человека 2018.01 с перипортальными гепатоцитами опытных крысят (p = 0,0001), однако центролобулярные гепатоциты характеризовались широкой вариабельностью размеров и формы данных органелл с преобладанием многочисленных мелких митохондрий с осмиофильным матриксом, что свойственно печени молодых крыс Вистар [2]. Перивенулярная паренхима печени опытных животных на светооптическом уровне характеризовалась преимущественно мономорфными клетками с оптически более светлой цитоплазмой, в том числе за счет баллонной дистрофии, иногда развивающейся до колликвационного некробиоза. Объемная плотность гепатоцитов значимо превышала лишь аналогичный показатель перипортальной зоны (p = 0,023). К фокусам деструкции приурочены единичные лимфоциты и макрофаги, «выселяющиеся» из расширенных перивенулярных синусоидов (рис. 1), значимо превосходящих по объемной плотности как свою контрольную группу (p = 0,007), так и пери-портальные синусоиды опытной группы (p = 0,008). Эти изменения согласованы с результатами ультраструктурного стереологического анализа периве-нулярных гепатоцитов - выявлено значимое (p = 0,001) увеличение цитоплазматического компартмента относительно объемной плотности цитоплазмы пе-рипортальных гепатоцитов. Одновременно с этим показатель ядер перивенулярных клеток опытной группы характеризовался значимым уменьшением относительно своей контрольной группы, а также объемной плотности ядер гепатоцитов перипорталь-ной и центролобулярной зон (табл. 2), что связано, в том числе, с более редкими двуядерными клетками в печеночных дольках вокруг центральных вен. По сравнению с показателем контрольной группы и другими компартментами печеночных долек выявлено высоко значимое (p = 0,0001) закономерное (в силу метаболической зональности [11]) уменьшение содержания в цитоплазме профилей цитоплазматической сети и приуроченных к ним митохондрий. В статистически большем объеме цитоплазмы взамен этих редуцированных белоксинтезирующих комплексов локализовались крупные полиморфные вакуоли со слабо осмиофильным хлопьевидным со держимым и более многочисленные мелкие везикулы. Независимо от внутридольковой локализации по сравнению с данными контрольной группы гепатоциты крысят опытной группы содержали большее количество лизосом и пероксисом; однако аутофагосомы и резидуальные тельца не выявлены. Перигепатоцел-люлярно встречались мелкие звездчатые клетки Ито с одной-двумя липидными каплями, без признаков фиброгенной трансформации. Эндотелий синусоидов и клетки Купфера не демонстрировали выраженных отличий ультраструктурной организации по сравнению с интактными животными. Обсуждение результатов Как известно, перипортальные гепатоциты отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности [12]. В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов. Это положение является базисом модели метаболической зональности [11], по которой преимущественно в перипортальных гепа-тоцитах наиболее активны глюконеогенез, утилизация аминокислот, детоксикация аммония, а также формирование желчи и синтез основных белков плазмы крови, в том числе альбумина и фибриногена. При этом защитный метаболизм сосредоточен в большей степени в центролобулярных и перивенулярных ге-патоцитах. Индукция в гепатоцитах цитохромов Р450 - эволюционно сформировавшийся адаптивный ответ на различные экзогенные воздействия, последствия которого определяют токсичность и канцерогенность многих ксенобиотиков, а также пути метаболизма лекарств; при этом деструкция гепатоцитов (цитолиз) - ведущий синдром токсического поражения печени любой этиологии [1]. Наряду с цитотоксичностью небольшие дозы Cd обладают эффектом гормезиса, в частности стимулируя клеточную пролиферацию клеток печени zebrafish и уменьшая процентное содержание клеток с маркерами апоптоза путем изменения экспрессии факторов роста и генов репарации ДНК; однако затем Cd-индуцированная геномная нестабильность, Таблица 2 Ультраструктурное стереологическое исследование гепатоцитов крыс Вистар (Vv, мм3/см3) при Cd-токсическом воздействии, М ± m Локализация в дольке Группа Ядра Цитоплазма Профили цитоплазматической сети Митохондрии Контроль 52,21 ± 2,71 103,31 ± 3,43 35,27 ± 2,56 161,94 ± 5,26 Перипортальная зона Опыт 56,90 ± 2,12 *p = 0,212 106,42 ± 4,58 *p = 0,762 25,37 ± 2,15 *p = 0,008 163,89 ± 3,93 *p = 0,791 Контроль 52,64 ± 2,24 134,96 ± 5,71 32,41 ± 3,37 156,59 ± 6,09 Центролобулярная зона Опыт 49,63 ± 2,33 *p = 0,307 #p = 0,038 151,04 ± 6,82 *p = 0,096 #p = 0,0001 29,69 ± 1,27 *p = 0,345 #p = 0,038 127,86 ± 2,68 *p = 0,002 #p = 0,0001 Контроль 51,64 ± 2,65 132,54 ± 3,85 23,84 ± 1,37 132,13 ± 3,46 Перивенулярная зона Опыт 42,79 ± 1,79 *p = 0,016 #p = 0,001 &p = 0,038 143,68 ± 4,95 *p = 0,082 #p = 0,001 &p = 0,326 17,49 ± 1,25 *p = 0,005 #p = 0,004 &p = 0,0001 102,04 ± 3,40 *p = 0,0001 #p = 0,0001 &p = 0,0001 50 Экология человека 2018.01 Экологическая морфология по данным [6, 7], могла инициировать канцерогенез. Гормезис лежит в основе и других эффектов, например, культивирование мышиных фибробластов в условиях низких доз Cd приводило к увеличению скорости метаболизма, но сопровождалось повышением продукции белков «теплового шока» [14]. Таким образом, выявленные нами структурные изменения печени крыс-adolescent Вистар на тканевом и клеточном уровнях отражают стереотипный характер деструктивных и компенсаторных процессов. Гепато-токсичность, в т. ч. лекарственно-индуцированная, сопровождается нарушениями кальциевого гомеостаза, оксидативным стрессом и митохондриальной дисфункцией с последующей инициацией повреждения и вероятной гибелью гепатоцитов [8, 15]. Деструкция паренхиматозных клеток печени является триггером активации других клеточных популяций, которые могут инициировать воспалительную реакцию и/ или адаптивный иммунный ответ и препятствовать регенерации печени [3, 9, 13]. Исследование воздействия субтоксичных доз Cd на печень экспериментальных животных неполовозрелого возраста (adolescent) с помощью представления о классической дольке позволяет выявить топографические особенности альтеративных и регенераторных реакций на тканевом и клеточном уровнях. По данным тканевого стереологического анализа в опытной группе отмечено синхронное нарастание объемной плотности паренхиматозного компартмента и синусоидов по сравнению с контрольной группой. По данным стереологического анализа ультра-структурной организации гепатоцитов обнаружено значимое прогрессирующее снижение объемной плотности органелл биосинтеза - гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий. Выявлен определенный баланс между альтеративными процессами токсического генеза и компенсаторными процессами молодого (4 недели) организма в паренхиме печени организма крыс-adolescents Вистар. Список литературы

About the authors

P A Elyasin

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Email: elyasin@ngs.ru
Novosibirsk, Russia

S V Zalavina

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

A N Mashak

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

Y R Ravilova

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

D M Pervoykin

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

A P Nadeev

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

S V Aidagulova

Federal State Budget Educational Foundation of the High Education «Novosibirsk State Medical University» of the Health Ministry of Russia

Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files