IMMUNOLOGIC REACTIVITY IN THE FIRST DAYS AFTER THE CRANIOCEREBRAL TRAUMA

Full Text

Наиболее значимым фактором, обусловливающим актуальность проблемы, является растущая частота черепно-мозговых травм (ЧМТ) среди населения, они составляет 25-40 % от всех видов травм в мире. Смертность при ЧМТ составляет 30 человек на 100 тысяч населения [10], причем свыше трети пострадавших умирают в лечебных учреждениях в первые трое суток после поступления. Важно социальное значение ЧМТ: наиболее часто подвергаются травме люди трудоспособного возраста (20-50 лет), а общее количество инвалидов достигает 57,8-85,5 % от всех пострадавших [11, 16]. Учитывая цензорную функцию иммунной системы, важно отметить, что реакции адаптивного иммунитета и эксквизитные (компенсаторные) иммунные реакции представляют собой класс защитно-приспособительных явлений, которые развиваются только в экстремальных условиях, представляют собой ответную реакцию на повреждение [1, 2, 4, 6], носят характер запаздывающих реакций, могут быть реакциями каскадного типа и могут компенсировать неврологический ущерб. Комплексное исследование с определением фенотипов иммунокомпетентных клеток и их соотношения в иммунном ответе, а также медиаторов воспаления (цитокинов) у пострадавших позволит определить адаптационные и компенсаторно-приспособительные иммунные реакции. Полученные данные могут быть использованы специалистами в прогнозе вероятных осложнений, что в конечном итоге повысит эффект реабилитации. Цель исследования - выявить реакции адаптивного иммунитета в первые сутки с момента получения травмы. Методы Проведен анализ иммунного статуса с определением клеточного иммунитета (зрелые функционально активные клетки CD3+, хелперы-индукторы CD4+, все Т-клетки CD5+, Т-супрессоры CD8+, нормальные киллеры CD16+, лимфоидная популяция клеток, отражающая уровень интерлейкина 2 (CD25+), транс-феррина (CD71+), апоптоза (CD95+), антигенов гистосовместимости 2-го класса HLA-DR+), лим-фопролиферации (CD 10+), определено содержание сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE) и интерлейкинов (IL)-2, -6, -10 у 110 мужчин в возрасте 20-40 лет с ЧМТ лёгкой (39 человек), средней (38 человек) и тяжелой степени (33 человека), проходящих лечение на базе Первой городской клинической больницы им. Е. Е. Волосевич и проживающих на территории г. Архангельска в период 2015-2016 годов. Для анализа использовали периферическую венозную кровь, взятую в первые сутки после получения травмы. Фенотипирование лимфоцитов проводили с использованием непрямой иммунопероксидазной реакции с применением моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр» и ООО «Сорбент», г. Москва) на препаратах лимфоцитов типа «высушенная капля». Приготовленные мазки рассматривались под микроскопом Nicon Eclipe 50i при иммерсионном увеличении объектива х90 и окуляра х7 с подсчетом 100 клеток на клавишных лабораторных счетчиках. Содержание сывороточных IgA, IgM, IgG, IgE и IL-2, IL-6, IL-10 определяли методом иммунофер-ментного анализа. Полученные результаты измеряли на планшетном иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2100. Все полученные результаты статистически обработаны с использованием пакета прикладных программ Microsoft Exœl и Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли при помощи критерия Шапиро - Уилка. Данные исследования представлены в виде их средних значений и средней ошибки (M ± m). Статистическую значимость различий между выборками выявляли при помощи t-критерия Стьюдента и с использованием непараметрических методов Крускала - Уоллиса и Манна - Уитни. Различия сравниваемых показателей принимались значимыми при р < 0,05-0,001. Уровень дисбалансов иммунологических показателей рассчитывался по данным частоты регистрации повышенных и пониженных их концентраций относительно нормативных пределов физиологических колебаний (%). Обследование проводили с письменного согласия респондентов с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации от 1964 года, с изменениями и дополнениями на 2008 год). Результаты Исследование состояния иммунной системы и её роли в формировании клинических проявлений и возможных осложнений у пострадавших с ЧМТ до настоящего времени остаётся малоизученной проблемой. С одной стороны, это связано с трудоёмкостью и сложностью методик исследований, с другой - со сложностью внутренних процессов формирования иммунного ответа. Немногочисленные литературные данные чаще всего отражают результаты биохимических исследований [19-24] или отдельных параметров иммунной системы (иммуноглобулины) при хирургических вмешательствах на головном мозге или в результате боевых (взрывных) травм [16]. Так, по данным А. А. Старченко с соавт. [10, 11], гуморальный иммунитет у пострадавших со взрывными повреждениями мозга средней степени тяжести характеризуется повышенными уровнями белков ликвора, более сильной активацией острофазовых показателей на третьи - пятые сутки по сравнению с аналогичными у пострадавших с лёгкой степенью взрывной ЧМТ. Противоположные данные представлены авторами по содержанию иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ): чем тяжелее травма, тем глубже и 48 Экология человека 2017.05 Медицинская экология длительнее иммунодепрессия. Отставание в активации синтеза указанных антител составляет трое - четверо суток. Указано, что у больных с благоприятным исходом отмечается активизация общей и местной иммунной системы, пропорциональная тяжести травмы. У лиц с крайне тяжёлыми повреждениями, заканчивающимися неблагоприятным исходом, авторами отмечено выраженное снижение показателей гуморального иммунитета в ЦСЖ. Способность иммунокомпетентных клеток к продукции IL-1, IL-2, IL-6 и др., а также возможность их проникновения в мозг обеспечивает активность функциональной цепи путем активирования Т-клеточных реакций, интенсивности иммуногенеза, хелперной активности, регуляции синтеза иммуноглобулинов [5, 8, 9, 13]. Кроме того, в более ранних наших исследованиях [6, 7, 12] среди мужчин 30-40 лет со средней степенью тяжести ЧМТ установлено, что у пострадавших с неблагоприятным исходом ЧМТ наблюдается развитие иммунологической недостаточности, появляющейся в результате как снижения хелперно-индукторной активности клеточного звена иммунной системы, так и подавления супрессорно-эффекторной активности Т-лимфоцитов, что также является неблагоприятным прогностическим признаком. Выявленная в ранних исследованиях [6, 7] повышенная Т-хелперная и Т-супрессорная активность у пострадавших мужчин на фоне регистрирующихся лейкоцитозов, повышенных уровней гемоглобина, лимфопении, низких концентраций эритроцитов и гематокрита может быть оценена как благоприятный прогноз с наименьшим риском развития осложнений при ЧМТ средней степени тяжести. Представляло интерес выявить реакции адаптивного иммунитета в первые сутки с момента получения ЧМТ у мужчин 20-40 лет г. Архангельска. Применение комплексного и детального иммунологического исследования с определением фенотипов иммуноком-петентных клеток, цитокинов, иммуноглобулинов и их соотношения в иммунном ответе у пострадавших позволит решить актуальные задачи исследования: определить параметры, которые помогут прогнозировать характер возможных осложнений, снизить удельный вес инвалидизации. Анализ показал, что в первые сутки после получения травмы концентрации всех Т-клеток (CD5+) и их зрелой функционально активной дифференцированной субпопуляции (CD3+) крайне низкие при норме 1-1,5 • 109 кл/л и 1-2 • 109 кл/л соответственно. При этом установлено, что уровень снижения содержания Т-клеточной популяции напрямую связан со степенью тяжести травмы у пострадавших (табл. 1). Исследуя содержание Т-хелперов (CD4 + ) и Т-супрессоров (CD8+) в зависимости от тяжести травмы, выявили: концентрации Т-хелперов находятся в пределах физиологической нормы (0,4-0,8 • 109 кл/л), при этом наименьшие их значения 0,45 -109 кл/л у лиц с тяжёлой степенью ушиба головного мозга. Супрессорная активность, напротив, превы- Таблица 1 Средние данные показателей клеточного иммунитета у лиц с черепно-мозговой травмой в возрасте 20-40 лет в г. Архангельске (М ± m) Показатель ЧМТ лёгкой степени ЧМТ средней степени ЧМТ тяжёлой степени СD3+ •109 кл/л 0,49±0,03 0,40±0,06 0,36±0,01*** СD4+ •109 кл/л 0,51 ±0,05 0,54±0,01 0,45 ±0,01 СD5+ •109 кл/л 0,53± 0,01 0,49±0,04 0,39 ±0,01 СD8+ •109 кл/л 0,57 ±0,06 0,56±0,06 0,47±0,05*** СD10+ -109 кл/л 0,51 ±0,02 0,48±0,03 0,39±0,04** СD16+ -109 кл/л 0,47±0,05 0,40±0,02 0,48±0,05 СD25+ -109 кл/л 0,51 ±0,01 0,37 ±0,05 0,58±0,05*** Œ71 + -109 кл/л 0,53±0,08 0,33±0,01 0,57 ±0,01 СD95+ -109 кл/л 0,59±0,06 0,35±0,02 0,66±0,03*** HLA-DR+ -109 кл/л 0,54±0,07 0,34±0,03 0,50±0,04 Примечание. *** - p < 0,001; ** - p < 0,01 при сравнении ЧМТ тяжёлой степени с ЧМТ лёгкой и средней степени. шает общеизвестные пределы (0,2-0,4 • 109 кл/л) и составляет в среднем (0,52 ± 0,05) • 109 кл/л. Хелперно-супрессорный коэффициент (CD4/CD8, k = 2) у пострадавших независимо от тяжести травмы составляет единицу при норме два, что свидетельствует о выраженной цитотоксической реакции [3, 15]. Содержание нормальных киллеров (CD16+) фиксировали ближе к верхним значениям физиологической нормы (0,4 -109 кл/л). Уровень лимфопролиферации (CD 10+) у пострадавших (0,51 ± 0,02); (0,48 ± 0,03) и (0,39 ± 0,04) -109 кл/л соответственно, как видно из представленных данных, количество указанных лимфоидных клеток значимо уменьшается в зависимости от степени тяжести травмы. Содержание лимфоидных популяций клеток-активаторов (CD25+ и CD71 + ) значимо увеличено среди пострадавших с тяжелой степенью ЧМТ. Важно отметить, что именно у этих лиц выявлены самые высокие уровни содержания Т-супрессоров (CD8+) и Т-киллеров (CD16+). Кроме того, у лиц с тяжелой степенью ЧМТ фиксировались повышенные значения клеток с рецептором к апоптозу (CD95+) - (0,66 ± 0,03) • 109 кл/л и лимфоцитов с антигенной детерминантой к антигенам гистосовместимости II класса (HLA-DR+) - (0,50 ± 0,04) -109кл/л. Для выявления полноты иммунного ответа в первые сутки с момента получения травмы проведен анализ содержания иммуноглобулинов и цитокинов. Как видно из данных табл. 2, среднее содержание IL-6 повышено у лиц с лёгкой и тяжелой степенью тяжести травмы. Обращает на себя внимание тот факт, что содержание IL-2 повышено у всех обследуемых групп независимо от степени тяжести ЧМТ. В то же время уровень содержания IL-10 в средних значениях во всех случаях невелик и составляет (4,44 ± 0,02) -109 кл/л. Концентрации иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определены в пределах физиологических норм у всех 49 Медицинская экология Экология человека 2017.05 обследуемых пострадавших мужчин, исключение составил IgE: так, в наших исследованиях повышенные концентрации IgE (реагина), отвечающего за аллергический фон организма в целом, отмечены у 25,0 % лиц со средней (104,06+0,03 кл/л) и у 16,7 % с тяжёлой степенью тяжести ЧМТ. Таблица 2 Средние данные показателей гуморального иммунитета и цитокинов у лиц с черепно-мозговой травмой в возрасте 20-40 лет в г. Архангельске (М ± m) Показатель ЧМТ лёгкой степени ЧМТ средней степени ЧМТ тяжёлой степени IL-6, пг/мл 0,45+0,06 0,93+0,01 42,22+0,06** IL-2, пг/мл 110,41+0,02 66,77+0,01 740,22 + 0,07** IL-10, пг/мл 4,27+0,01 4,54+0,03 4,56+0,03 IgM, г/л 2,08+0,01 2,13+0,07 1,93+0,05 IgA, г/л 0,89+0,04 0,96+0,01 1,3+0,01 IgE, МЕ/мл 100,73+0,01 104,06+0,03 54,18+0,05 IgG, г/л 5,77+0,03 6,16+0,06 6,08+0,06 Примечание. ** - p < 0,01 при сравнении ЧМТ тяжёлой степени с ЧМТ лёгкой и средней степени. Предварительный анализ показал, что у мужчин 20-40 лет выявлены однотипные реакции при лёгкой и тяжёлой ЧМТ, а именно повышенные концентрации супрессоров CD8+, натуральных киллеров CD 16+, IL-2 (CD25+), клеток с рецепторами к трансферрину CD71+, к апоптозу CD95+, IL-2, -6, -10 в сыворотке крови. Концентрации хелперов CD4+ находятся на нижней границе физиологической нормы. Кроме того, независимо от вида травмы в первые сутки у пострадавших регистрируется выраженный дефицит всей Т-клеточной популяции CD5+ и зрелых функциональных лимфоцитов CD3+. Однако у мужчин с ЧМТ средней степени тяжести натуральные киллеры CD16+, цитокины CD25+, клетки с рецепторами к трансферрину, апоптозу и антигенам гистосовместимости II класса регистрируются в крайне низких концентрациях на фоне повышенных значений IgE. Таким образом, отличительной особенностью иммунного ответа у мужчин 20-40 лет с ЧМТ является повышенная цитокиновая активность при ЧМТ средней и тяжёлой степени, а именно IL-2, -6, повышенный IgE. Представляло интерес определить долевое соотношение иммунных дисбалансов и частоту их регистрации у обследуемых лиц в зависимости от тяжести травмы. Известно, что количество клеток, пределы их содержания, в том числе отдельных фенотипов лимфоцитов, иммуноглобулинов отражают состояние иммунного фона. Однако количественная оценка концентраций иммунокомпетентных клеток информативна только в крайних случаях - дефицита или повышения относительно нормы их содержания [14]. В то же время процессы кооперации и координации клеточного взаимодействия имеют основное значение в формировании иммунного статуса и иммунных реакций, поскольку и медиаторы, и цитокины, и рецепторы являются продуктами жизнедеятельности тех же клеток [1]. На данный момент нет сведений о фоновых изменениях параметров иммунного гомеостаза у лиц с ЧМТ с учётом кооперации и координации активности различных фенотипов клеток, служащих предикторами развития вторичных экологически зависимых иммунодефицитов и формирования их клинических проявлений, а также возможных осложнений после травм. В то время как фон и начальные этапы иммунных реакций являются определяющими для формирования эффективной иммунной защиты или ответа с развитием последующих функциональных расстройств [3]. В одних и тех же ситуациях регистрируют и повышение, и снижение содержания в крови цитотоксических клеток, хелперов и нормальных киллеров; имеются данные и о синхронных параллельных изменениях их концентраций [14, 18]. Различные комплексы факторов долговременного действия, способные оказывать неблагоприятное влияние на организм человека, обусловливают фактически однотипные реакции, характерные для хронического стресса. Иммунная система отвечает при этом повышенным фоновым уровнем активизации клеточноопосредованных и антителозависимых реакций, системы комплемента альтернативным и классическим путем [1] с последующим сокращением резервных возможностей иммунной системы [17] и формированием экологически зависимого вторичного иммунодефицита. [12]. Так, в наших исследованиях частота встречаемости дефицитов уровней содержания иммунологических параметров регистрировалась значительно чаще у лиц с лёгкой степенью тяжести травмы, чем повышенное их содержание у пострадавших. Следует отметить, что основным дефектом иммунной защиты у лиц с лёгкой степенью тяжести ЧМТ в долевом соотношении является дефицит содержания тех или иных параметров: от 10,0 % (IgE) до 80,0 % (IgG) случаев в зависимости от показателя. Повышенные значения отдельных фенотипов лимфоцитов и иммуноглобулинов встречались в пределах от 5,6 % (CD3+, CD8+) до 55,0 % (IgM, IL-2) случаев, что свидетельствует об активации как клеточного, так и гуморального звена адаптивного иммунитета. C возрастанием степени тяжести травмы у пострадавших меняется спектр иммунологических дисбалансов: так, у лиц со средней степенью тяжести (исключая характерный для всех северян дефицит клеток CD5+) дефицит содержания иммунологических показателей встречается уже от 37,5 % (CD4+) до 77,8 % (CD95+; CD25+; IgG) случаев [8, 11]. Аналогичная ситуация у лиц с тяжёлой степенью ЧМТ: дефицит содержания иммунологических показателей встречается от 50,0 % (CD4+) до 83,3 % (CD3+, CD25+, CD71 + , HLA-DR+, IgG) случаев. Частота встречаемости повышенных значений иммунологических показателей увеличивается (p < 0,01) среди лиц со средней степенью тяжести травмы от 50 Экология человека 2017.05 Медицинская экология 25.0 % респондентов (CD10+, CD16+, IL-2, CD8+) до 66,7 % (IgE, IL-2, IL-6); среди лиц с тяжёлой степенью ЧМТ у 16,7 % пострадавших до 100,0 % (CD8+, CD16+, Œ71+, СD95+, CD25+, IL-6, IL-10, IgE, IgM, HLA-DR+), при этом изменяется их разнообразие, в адаптивный иммунный ответ вовлекается более широкий спектр показателей. Выявлено, что в чрезвычайных ситуациях в ответ на повреждающее действие активируется механизм иммунологической компенсации путём увеличения рецепторно-антигенного аппарата лимфоидных популяций, замещения синтеза одних иммуноглобулинов другими: IgE и IgM замещают соответственно IgA и IgG. Выраженная иммуносупрессия, лимфопролиферация, апоптоз и цитокиновая активность встречаются от 20,0 до 80.0 % случаев в зависимости от показателя и степени тяжести травмы. Важно подчеркнуть, что с возрастанием степени тяжести травмы значимо увеличивается цитокиновая активность со стороны IL-2, IL-6, IL-10. Основными продуцентами IL-2 являются Т-хелперы. Около 20.0 % цитотоксических Т-клеток также способны к продукции данного цитокина. По результатам нашего исследования, именно у лиц с тяжелой степенью ЧМТ отмечается увеличение концентраций как клеток с рецепторами CD4+, так и цитотоксических клеток CD8+ (р < 0,01). В результате получения сигнала клетка активируется, что проявляется, в частности, в усилении ее пролиферации (увеличение концентрации CD10+, отвечающих за лимфопролиферацию, возрастает до 60-66,7 %). Одним из белков цитокинов является IL-6, выполняющий огромное количество функций. Он активирует продукцию белков острой фазы воспаления, участвуя в иммунной защите организма, а также участвует в пролиферации и дифференцировке В- и Т-клеток. Интерлейкин-10 является важнейшим регулятором цитокинов, во многом определяющим направленность иммунной реакции: под действием IL-10 угнетается клеточный ответ (регулируется Т-хелперами 1-го типа) и усиливается гуморальный ответ (Т-хелперы 2-го типа). Важно отметить, что в первые сутки после получения травмы повышение значений цитокиновой и цитотоксической активности свидетельствует о выраженном напряжении в системе иммунитета, подобная адаптивная и приспособительная реакция в дальнейшем способствует сокращению резервных возможностей иммунного гомеостаза у пострадавших и развитию вторичных экологически зависимых иммунных дисбалансов. Обсуждение результатов Таким образом, в первые сутки после получения травмы независимо от степени её тяжести среди мужчин 20-40 лет повышенная клеточноопосредованная цитотоксичность за счёт фенотипов лимфоцитов CD8+ и CD 16+, вероятно, является компенсаторно-приспособительной иммунной реакцией при выраженном дефиците Т-клеточной популяции (CD5+), дефиците её зрелой функци ональной активной субпопуляции (CD3+). Характерной особенностью для пострадавших c тяжёлой степенью ЧМТ является повышенное содержание клеток-активаторов CD25+, CD71 + , стимулирующих иммунные реакции по классическому пути, повышенные уровни апоптоза CD95+ и В-клеточной активации HLA-DR+, цитокинов IL-2, IL-6, IL-10 на фоне высокой цитотоксической активности и общего дефицита Т-клеточной популяции. Физиологическая регуляция иммунного ответа характеризуется вовлечённостью минимального количества фенотипов лимфоцитов и других иммунологических показателей, меньшим удельным весом их от общего количества лимфоцитов и минимальным количеством жёстких корреляционных взаимосвязей [14]. Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что увеличение разнообразия вовлечённости фенотипов лимфоцитов, больший удельный вес их от общего количества лимфоцитов, иммуноглобулинов и цитокинов, множество жёстких корреляционных связей у пострадавших в первые сутки после получения травмы независимо от степени тяжести способствуют формированию иммунных дисбалансов, что в конечном итоге может проявиться развитием вторичных экологически зависимых иммунодефицитов как посттравматического осложнения.

About the authors

L S Shchegoleva

Federal Research Center of Complex Studying of the Arctic of the Russian Academy of Sciences; Northern (Arctic) Federal University named after M. V. Lomonosov

Email: shchegoleva60@mail.ru
Arkhangelsk, Russia

E V Popovskaya

Federal Research Center of Complex Studying of the Arctic of the Russian Academy of Sciences; First Municipal Clinical Hospital named after E. E. Volosevich

Arkhangelsk, Russia

E Yu Shashkova

Federal Research Center of Complex Studying of the Arctic of the Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk, Russia

O E Sidorovskaya

Federal Research Center of Complex Studying of the Arctic of the Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk, Russia

S N Balashova

Federal Research Center of Complex Studying of the Arctic of the Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files