ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HUMAN MIXED SALIVA IN NORM

Full Text

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, 80 % заболеваний на сегодняшний день связаны с экологическим неблагополучием среды обитания. В первую очередь это касается населения промышленных центров, где приоритетное место принадлежит химическому загрязнению окружающей среды [9]. В связи с этим мониторинг состояния здоровья жителей промышленного города является одной из приоритетных задач прикладной экологии [5]. Несмотря на значительное число исследований, направленных на выяснение механизма действия химических факторов внешней среды на состояние здоровья населения, проблема оценки комплексного влияния поллютантов остается нерешенной [13]. Известно, что одним из механизмов, через которые реализуется воздействие факторов окружающей среды на организм человека, является «окислительный стресс». В настоящее время большое количество исследований посвящено проблеме соотношения продукции свободных радикалов в норме и при различных патологиях, а также способности системы антиок-сидантной защиты (АОЗ) эффективно блокировать их негативное воздействие [18]. Антиоксидантная защита организма состоит из ферментативного звена, включающего антиоксидантные ферменты (суперок-сиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатионредуктаза и др.), и неферментативного звена, содержащего низкомолекулярные вещества-антиоксиданты (вита 36 Экология человека 2017.06 Медицинская экология мины, глутатитон, мелатонин и др.). Баланс генерации свободных радикалов и система АОЗ оцениваются по накоплению различных продуктов - диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, оснований Шиффа, уровню окисленности белка [16]. Другие подходы к оценке антиоксидантной активности (АОА) - это исследование кинетики блокирования относительно стабильных радикалов, генерируемых непосредственно в реакционной среде, либо оценка скорости потребления кислорода [15]. При этом в зависимости от типа используемого радикала оцениваются различные компоненты системы АОЗ. Существующие методы определения АОА подразделяются на кулонометрические, хемилюминесцентные и спектрофотометрические, включая определение отдельных компонентов системы АОЗ, и интегральные методы [6, 7, 10]. Характер изменений состояния основных звеньев АОЗ изучают в различных тканях и органах, внутри- и внеклеточных жидкостях (бронхоальвеолярной, мозговой, слезной, плазме крови) [10, 19], пристеночном слизистом слое верхних отделов пищеварительного тракта [13], а также в слюне [6, 7, 10, 17]. В качестве материала для изучения свободнорадикальных процессов могут использоваться также клетки крови [14, 20]. Целью исследования являлась разработка подходов к оценке выраженности «окислительного стресса» посредством определения активности антиоксидант-ных ферментов и АОА слюны человека и изучение вариации данных показателей в норме. Методы В исследовании приняли участие 20 здоровых добровольцев (10 мужчин, 10 женщин) в возрасте (31,8 ± 0,9) года. Пробы слюны собирали в течение суток каждые 3 часа (в 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 часа), а также в течение недели в утренние часы (время максимальной секреции) в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 7 000 об./мин [4]. Во всех образцах определяли активность СОД, каталазы и АОА. Антиоксидантную активность выявляли по регистрации скорости окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде [12]. В стандартную стеклянную пробирку вносили 0,5 мл фосфатного буферного раствора рН=7,40, 150 мкл раствора 2,6-ДХФИФ (0,8 мМ) и 150 мкл раствора Fe2SO4 (3,2 мМ). Затем перемешивали и добавляли 100 мкл слюны, измеряли оптическую плотность против дистиллированной воды в течение 5 мин (X = 600 нм). Параллельно проводили холостой опыт, используя вместо раствора Fe2SO4 дистиллированную воду. Для стандартизации исследования в качестве антиоксиданта в контрольном опыте использовался водорастворимый синтетический аналог витамина Е - тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) с концентрацией 2,14 ммоль/л. Концентрацию антиоксидантов в образце (АОА) рассчитывали по формуле: ^ ДЕ хол - ДЕ оп ^ С = ДЕ _ ДЕ Х Ск. /ДЕхол /ДЕкал Активность СОД определяли по накоплению продукта автоокисления адреналина супероксидным анион-радикалом в щелочной среде, активность каталазы _ по методике М. А. Королюка [4]. Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспар-татаминотрансферазы (АСТ) определяли по методу Райтмана _ Френкеля с использованием наборов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Рассчитывали среднюю арифметическую величину (М), стандартную ошибку от средней арифметической (m). В зависимости от формы распределения применяли два вида статистических критериев: параметрические (t-критерий Стьюдента) и непараметрические (U-критерий Вилкоксона). Результаты На первом этапе исследования определяли отдельные антиоксидантные ферменты в слюне здоровых людей (табл. 1). Среднесуточные показатели для мужчин и женщин приведены в табл. 2. Таблица 1 Антиоксидантные ферменты смешанной слюны в норме Время, ч АЛТ, Е/л АСТ, Е/л АСТ/АЛТ Каталаза, мкат/л СОД, у. е. 3 4,66 ± 0,82 6,13 ± 0,85 1,54 ± 0,26 3,04 ± 0,34 95,70 ± 22,40 6 5,03 ± 0,95 6,42 ± 1,22 1,36 ± 0,17 2,71 ± 0,37 128,60 ± 55,40 9 4,21 ± 0,64 6,57 ± 0,96 1,72 ± 0,25 2,84 ± 0,47 62,80 ± 11,30 12 5,19 ± 0,93 6,91 ± 0,94 1,50 ± 0,22 2,61 ± 0,52 52,30 ± 16,60 15 4,76 ± 0,64 6,08 ± 0,84 1,32 ± 0,16 2,75 ± 0,42 94,70 ± 32,40 18 5,36 ± 0,82 6,92 ± 1,04 1,39 ± 0,20 2,38 ± 0,25 118,40 ± 33,60 21 5,13 ± 1,21 6,46 ± 1,26 1,30 ± 0,09 2,26 ± 0,34 78,90 ± 34,10 24 5,20 ± 1,05 6,16 ± 0,87 1,49 ± 0,31 2,86 ± 0,58 66,50 ± 19,30 Таблица 2 Среднесуточные значения активности ферментов в зависимости от пола Параметр Мужчины (n = 10, t = 1,96) Женщины (n = 10, t = 1,96) Среднее значение Каталаза, мкат/л 3,11 ± 0,39 2,26 ± 0,24 2,68 ± 0,34 СОД, у. е. 87,00 ± 12,70 87,50 ± 16,80 87,30 ± 15,90 АЛТ, Е/л 4,85 ± 0,56 5,03 ± 0,72 4,94 ± 0,75 АСТ, Е/л 6,25 ± 0,78 6,66 ± 0,94 6,45 ± 0,87 АСТ/АЛТ 1,49 ± 0,11 1,42 ± 0,20 1,45 ± 0,17 Согласно приведенным данным, статистически значимых отличий по средним показателям не на 37 Медицинская экология Экология человека 2017.06 блюдалось, однако была отмечена периодичность изменения параметров в течение суток. Так, изменение активности СОД происходило в противофазе для мужчин и женщин (рис. 1), при этом у мужчин наблюдался максимум в дневные часы, у женщин - в ночные (3-6 часов утра). Интересно отметить, что среднесуточные показатели активности СОД в обеих группах практически одинаковы (см. табл. 2). Рис. 1. Динамика суточной активности супероксиддисмутазы в зависимости от пола Активность каталазы в обеих группах повышалась в дневные часы и снижалась к вечеру (рис. 2). Среднее значение активности каталазы для мужчин и женщин составило 3,11 ± 0,27 и 2,26 ± 0,38 соответственно (по обеим группам (2,68 ± 0,34) мкат/л). О 3 6 9 12 15 18 21 24 Рис. 2. Изменение суточной активности каталазы Антиоксидантную активность слюны определяли в течение суток с интервалом в 3 часа. Результаты приведены на рис. 3. Рис. 3. Динамика суточной антиоксидантной активности слюны Амплитуда АОА была незначительна, наблюдалось два локальных максимума, соответствующих 15 часам дня и 3 часам ночи, при этом среднее значение составило (2,01 ± 0,13) мМ. Отмечены суточные особенности изменения АОА в зависимости от пола (табл. 3). Так, минимальное значение АОА у женщин приходилось на 18 часов, тогда как у мужчин - на 21 час вечера с постепенным увеличением до максимума в 3-6 часов утра. Таблица 3 Антиоксидантная активность слюны в зависимости от пола Время, ч Мужчины Женщины Среднее значение 3 2,07 ± 0,15 2,28 ± 0,11 2,18 ± 0,13 6 2,03 ± 0,16 2,08 ± 0,15 2,06 ± 0,15 9 1,98 ± 0,21 2,16 ± 0,09 2,07 ± 0,15 12 1,97 ± 0,15 1,97 ± 0,12 1,95 ± 0,12 15 1,91 ± 0,12 2,24 ± 0,02 2,20 ± 0,17 18 1,79 ± 0,19 1,94 ± 0,13 1,88 ± 0,16 21 1,47 ± 0,21 2,03 ± 0,09 1,75 ± 0,19 24 1,91 ± 0,27 2,00 ± 0,05 1,96 ± 0,18 Обсуждение результатов К специфическим антиоксидантным ферментам относят СОД, каталазу, глутатионпероксидазу, глу-татионредуктазу и трансферазы [17, 18]. Эта группа ферментов локализуется преимущественно внутри-клеточно и обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Известно, что мониторинг активности СОД и ка-талазы позволяет оценить степень влияния экологической обстановки, в том числе химических факторов среды обитания, на здоровье населения [1, 3]. Поэтому первостепенным, на наш взгляд, является установление нормальных значений данных параметров для региона с учетом половозрастных особенностей. Ввиду неоднозначного характера изменения активности каталазы и СОД интерпретация получаемых результатов может быть затруднена, поэтому более целесообразно использовать интегральные показатели, в частности АОА. Суточные колебания можно объяснить тем, что показатель АОА отражает содержание в биологических жидкостях низкомолекулярных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами (витамины, серосодержащие аминокислоты, глутатион, мелатонин и т. д.). По химической структуре мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) представляет собой производное биогенного амина серотонина, который, в свою очередь, синтезируется из аминокислоты триптофана, поступающей с пищей. Установлено, что мелатонин образуется в клетках эпифиза, а затем секретируется в кровь, преимущественно в темное время суток, ночью, тогда как на свету, в утренние и дневные часы, выработка гормона резко подавляется. Максимальное содержание мелатонина в организме человека наблюдается в 2 часа ночи [2]. Мелатонин связывает сво 38 Экология человека 2017.06 Медицинская экология бодные радикалы кислорода, одновременно запуская естественную систему АОЗ через активацию СОД и каталазы. В исследованиях in vitro было выявлено, что мелатонин обладает значительно большей АОА в плане прерывания процессов перекисного окисления липидов и инактивации активных свободных радикалов -OH и ROO-, чем известные антиоксиданты [8]. Можно предположить, что повышение АОА слюны в ночные часы обусловлено повышенной продукцией мелатонина [6]. Акрофаза АОА в дневные часы также может быть связана с повышением активности каталазы, в ночные - СОД [11]. Для подтверждения данного предположения были рассчитаны коэффициенты корреляции по Спирмену (p < 0,05). Отмечена положительная корреляция между активностью каталазы и АОА (r = 0,76) на протяжении суток, а также отрицательная корреляция между активностью СОД и АОА (r = -0,48) в дневные часы. Установлена взаимосвязь между суммарной АОА слюны и активностью ами-нотрансфераз, что подтверждается отрицательными коэффициентами корреляции (r = -0,74 для АЛТ, r = -0,71 для АСТ). Увеличение активности амино-трансфераз, по-видимому, связано с повреждением клеточных мембран, что, в свою очередь, увеличивает генерацию свободных радикалов и снижает АОА слюны. При наблюдении за показателями АОА в течение недели отмечено их относительно стабильное значение без ярко выраженных минимумов и максимумов, что позволяет использовать среднее значение данного показателя для сравнительных исследований (1,95 ± 0,05) мМ. Выводы: 1. Активность индивидуальных антиоксидантных ферментов достаточно сильно варьирует даже в течение суток, в связи с чем интерпретация полученных значений затруднена. 2. Наиболее перспективным показателем для оценки интенсивности «окислительного стресса» может выступать АОА биологических жидкостей, в частности слюны. 3. Подобрана методика определения АОА слюны с использованием 2,6-дихлорфенолиндофенола. 4. Определены хронофизиологические особенности динамики АОА слюны в норме, показана стабильность данного параметра с учетом половозрастных характеристик.

About the authors

L V Bel'skaya

Email: LudaB2005@mail.ru
Omsk State Technical University, ChemService Moscow Omsk, Russia

E A Sarf

ChemService Moscow

V K Kosenok

ChemService Omsk State Medical University Moscow Omsk, Russia

Zh Massard

University Hospital of Strasbourg Strasbourg, France

References

Supplementary files